|
Productdetails:
|
| Productennaam: | qPCR | Opslagtemperatuur: | – 20 °C |
|---|---|---|---|
| Robuust en actief voor cDNAsynthese: | tot 55°C. | Toepassing: | PCR |
| Volume: | 1ml | Omgekeerde transcriptie: | temperatuurwaaier (42-60°C) |
| Hoog licht: | Universele TaqMan Samengestelde QPCR,TaqMan Samengestelde QPCR Biochemische Reagens,1ml TaqMan Samengestelde QPCR |
||
Universele samengestelde qPCR hoofdmengeling van TaqMan
De principes van het inleidingsontwerp:
1. De lengte van versterkingsproduct wordt geadviseerd om tussen 80-300 bp te zijn;
2. Inleidingslengte: 18-25 bp;
3. De inhoud van basis G+C in inleidingen zou tussen 40%-60% moeten zijn;
4. Het Tm waardeverschil tussen voorwaartse inleidingen en omgekeerde inleidingen is minder dan 2℃, en de Tm waarde tussen 58-62℃ is het beste;
5. Willekeur van basisdistributie;
6. De inleidingen zouden geenbijkomende opeenvolgingen moeten bevatten, anders zullen zij een secundaire haarspeldstructuur vormen;
7. Er zou moeten zijn neen meer dan 4 bijkomende of homologe basissen tussen twee inleidingen, anders zal het inleidingsdimeer worden gevormd, vooral bijkomende overlapping bij ' eind 3;
8. ' Eindbasis 3 van de inleiding wordt voorgesteld om G of C te zijn;
9. Geen andere niet-specifieke producten werden gevonden in NCBI-vergelijkingsresultaten.
Inleiding van Universele samengestelde qPCR hoofdmengeling van TaqMan:
Dit product is een 2x-premix oplossing voor qPCR die Groene I hersenschimmige de fluorescentiemethode gebruiken van GSK. De kerncomponent, Taq-de Polymerase van DNA, is een hitte-geactiveerde die DNA-Polymerase door antilichamenmethode wordt geblokkeerd, die niet-specifieke versterking in de lage temperatuuromstandigheden kan effectief remmen. Ondertussen, gecombineerd die met de reactiebuffer voor qPCR wordt geoptimaliseerd, Taq-is de Polymerase van DNA zeer geschikt voor hoge specificiteit en gevoeligheids qPCR reactie. Een goede standaardkromme kan op een breed kwantitatief gebied worden verkregen, dat nauwkeurig, reproduceerbaar en betrouwbaar is voor de kwantitatieve analyse van doelgenen. Tegelijkertijd, bevat dit product een speciale Passieve de Verwijzingskleurstof van ROX die voor gebruik in alle qPCRinstrumenten geschikt is, en er is geen behoefte om de ROX-concentratie op verschillende instrumenten aan te passen. De blauwe kleurstof wordt toegevoegd in premix, die het traceurseffect van het toevoegen van steekproeven heeft, en de gele malplaatjeverdunner wordt tegelijkertijd verstrekt. Wanneer het malplaatje met gele malplaatjeverdunner wordt verdund en in blauwe reactiepremix toegevoegd, verandert de kleur van blauw tot groen, die een traceursrol in de voorbereiding van het proces van het reactiesysteem kan spelen en lekkage of misaddition verhinderen. De spectrums van de blauwe en gele kleurstoffen overlappen niet met de qPCRkleurstoffen en beïnvloeden niet de reactieresultaten.
De het analyseprotocol/Procedures over Universele TaqMan seinen qPCR hoofdmengeling simultaan over:
1. (Facultatieve) malplaatjeverdunning:
Deze uitrusting verstrekt een Buffer van de het Malplaatjeverdunning van 40x GELE, een 40 vouwen verdunde Gele Malplaatjeverdunning die kan worden gebruikt om nauwkeurig te bepalen of het Malplaatje aan de vloeistof van de qPCRreactie door de kleur van de vloeistof te veranderen is toegevoegd. Nemend het de reactiesysteem van 20ul qPCR als voorbeeld, volgens het bedrag van het verdunningsmalplaatje in de de reactieoplossing van 20ul qPCR wordt toegevoegd, kan de overeenkomstige verdunningsmethode van het originele malplaatje naar de volgende lijst die (het originele die malplaatje nemen aan 100ul wordt verdund die als voorbeeld) worden doorverwezen:
| Voeg het verdunde malplaatje aan de de reactieoplossing van 20ul qPCR (toe ul) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Voeg de Buffer van de het Malplaatjeverdunning van 40x GELE aan het 100ul-Systeem van de Malplaatjeverdunning (toe ul) | 50 | 25 | 16.7 | 12.5 | 10 | 8.4 | 7.2 | 6.3 |
| Voeg het 100ul-Systeem van de Malplaatjeverdunning aan het primaire malplaatje (ul) toe | x | x | x | x | x | x | x | x |
| volume van het toevoegen van Nuclease - Vrij Water (ul) | 50-x | 75-x | 83,3-x | 87,5-x | 90-x | 91,6-x | 92,8-x | 93,7-x |
Voorbeeld:
het 2ul verdunde malplaatje zou aan de reactiesysteem van 20ul moeten worden toegevoegd qPCR.
Nemend het 100ul-systeem van de Malplaatjeverdunning als voorbeeld, wanneer het oorspronkelijke Malplaatjevolume 20ul is, Buffer van de het Malplaatjeverdunning van 25ul 40x wordt de Gele toegevoegd, en dan wordt het nuclease-Vrije Water 55ul toegevoegd aan het totale volume van 100ul.
De BUFFER van de het MALPLAATJEverdunning van 40x GELE is nu 10x. Voeg 2ul van het verdunde Malplaatje in een 20ul-Buffer van de Verdunningsverdunning toe, en de definitieve 40× GELE Buffer van de Malplaatjeverdunning is 1x. Samenvattend, zou de Gele Buffer van de Malplaatjeverdunning 1x in het definitieve qPCRsysteem moeten zijn.
Productinformatie van Universele samengestelde qPCR hoofdmengeling van TaqMan:
| Productnaam | Identificatie van product | Model |
| Universele samengestelde qPCR hoofdmengeling van TaqMan | Gs-mbp0044-01 | 1ml |
| Gs-mbp0044-05 | 5×1 ml | |
| Gs-mbp0044-15 | 15×1 ml |
Opslag en Behandelings de Voorwaarden met Universele TaqMan seinen qPCR hoofdmengeling simultaan over:
Het natte vervoer van de ijszak; Opgeslagen bij temperatuur -20℃, geldig 12 maanden.
Nota: Als het malplaatje niet te hoeven worden verdund, of als de malplaatjeverdunner van g3362-2 niet wordt gebruikt, kunt u deze stap negeren.
2. PCRreactieprocedure(kanvolgensdeinstrumentenwordenaangepast):
a: Als de versterkingsspecificiteit moet worden verbeterd, de procedure kan in twee stappen of de onthardende temperatuur worden gebruikt; Om de versterkingsefficiency te verbeteren, kan een procedure in drie stappen of een uitbreidingstijd worden gebruikt.
Nota:
1. Gelieve te dragen beschikbare handschoenen tijdens verrichting om RN-aseverontreiniging te vermijden.
2. De omgekeerde transcriptieproducten kunnen bij -20℃ voor een korte tijd worden opgeslagen. Als de opslag op lange termijn nodig is, wordt het geadviseerd om hen bij -80℃ na verpakking op te slaan om herhaalde freeze-thaw cycli te vermijden.
3. Als het malplaatje van eukaryotic oorsprong is, wordt het geadviseerd om Oligo (dT) Inleiding te selecteren 18 en het in paren te rangschikken met de 3 ' Polya staart van eukaryotic mRNA om de hoogste opbrengst van cDNA van gemiddelde lengte te verkrijgen.
4. Voor omgekeerde transcriptie van prokaryotic RNA, zou de Willekeurig Inleiding of Gene Specific Primer van Hexamer moeten worden gebruikt.
5. De willekeurige Hexamer-Inleiding heeft brede toepasselijkheid en is geschikt voor mRNA, rRNA, tRNA, kleine RNA en lncRNA malplaatjes.
6. Als de omgekeerde transcriptie door qPCRanalyse wordt gevolgd, kunnen Oligo (dT) Inleiding 18 en de Willekeurige Hexamer-Inleiding worden gemengd om cDNA synthese tot efficiency in alle gebieden van mRNA hetzelfde te maken, dat helpt om de authenticiteit en de herhaalbaarheid van kwantitatieve resultaten te verbeteren.
7. Als de verdere qPCRinleidingen over exons worden ontworpen, kan de stap van de genoomverwijdering worden weggelaten.
Gemeenschappelijke problemen en oplossingen:
| Probleembeschrijving | Mogelijke redenen | Oplossingen |
| Aan het eind van de reactie, verscheen geen versterkingskromme of CT de waarde leek te laat | De malplaatjeconcentratie is te laag | Herhaal het experiment om het veelvoud van de malplaatjeverdunning te verminderen, en begin van de hoogste concentratie wanneer de steekproefconcentratie onbekend is |
| Malplaatjedegradatie | Het malplaatje werd opnieuw voorbereid en het experiment werd herhaald | |
| Er zijn PCR inhibitors in het systeem | Over het algemeen, wordt het malplaatje binnen gedragen, wordt de verdunningsverhouding van het malplaatje verhoogd of het malplaatje met hoge zuiverheid is reprepared en herhaalde | |
| De inleidingen kunnen degraderen | De inleidingen die niet lange tijd zijn gebruikt zouden eerst voor integriteit door PAGINAelektroforese moeten worden getest om de mogelijkheid van degradatie uit te sluiten | |
| Lage versterkingsefficiency | ncrease de inleidingsconcentratie, probeert een versterkingsprocedure in drie stappen, of herontwerpt de inleiding | |
| Het versterkingsproduct is te lang | De lengte van het versterkingsproduct werd gecontroleerd in de waaier van 80-300 bp | |
| De lege controle toont het signaal | De verontreiniging van het reactiesysteem | Ten eerste, zou het lege controlewater moeten worden vervangen. Als dezelfde situatie nog voorkomt, zouden de inleidingen, de aspirators en PCR de buizen moeten worden vervangen of een nieuwe Hoofdmengeling zou moeten zijn begonnen. Het reactiesysteem is in een super schone lijst bereid om aërosolverontreiniging te verminderen |
| De niet-specifieke versterking zoals inleidingsdimeer verschijnt |
Over het algemeen, is het normaal voor de versterkingsproducten om in lege controle na 35 cycli te verschijnen, die met de smeltende kromme zouden moeten worden geanalyseerd. De herontwerpinleiding, past inleidingsconcentratie aan of optimaliseert PCR reactieprocedure |
|
| De smeltende kromme heeft veelvoudige pieken | Het inleidingsontwerp is slecht | De nieuwe inleiding werd herontworpen volgens de principes van het inleidingsontwerp |
| De inleidingsconcentratie is te hoog | Verminder geschikt inleidingsconcentratie | |
| Er is genomic verontreiniging in cDNAmalplaatje | De gehaalde RNAoplossing wordt verteerd gebruikend DNA-enzymen, zoals DSDNase, om genomic verontreiniging te verwijderen, of transintron inleidingen te ontwerpen | |
| Slechte reproduceerbaarheid van experimenten | De fout van het toevoegen van steekproef is groot |
Het gebruik van nauwkeurige pipet, met hoogte - de hoofd nauwkeurige pipet van de kwaliteitszuiging; Hoog verdunningsmalplaatje, die groot volumemalplaatje toevoegen om bemonsteringsfout te verminderen; Het reactievolume van qPCR werd vergroot |
| De malplaatjeconcentratie is te laag | Herhaal het experiment om de verdunningstijden van het malplaatje te verminderen | |
| Temperatuurafwijking bij verschillende plaatsen van het qPCRinstrument | Kalibreer regelmatig het qPCRinstrument | |
| De versterkingskromme is niet vlot | Het fluorescentiesignaal is te zwak, geproduceerd na systeemcorrectie |
Zorg ervoor dat de kleurstoffen in de Hoofdmengeling vooraf die worden gemengd die niet worden gedegradeerd; Vervang fluorescent signaal om betere qPCRverbruiksgoederen te verzamelen |
| De onderbrekingen of de misstappen van de versterkingskromme | De malplaatjeconcentratie was hoger en de waarde van het basislijneindpunt was groter dan de CT waarde | Het basislijneindpunt (Ct waarde -3) werd verminderd en de gegevens werden opnieuw geanalyseerd |
| Versterkingskrommen van individuele scherp plotseling gelaten vallen Putten | Er zijn bellen in de reactiebuis |
Zorg ervoor dat de MENGELING volledig wordt opgelost, en wervel niet gelijk en oscilleer; Nadat de steekproef wordt toegevoegd, worden de bellen verwijderd door centrifugeren met licht elastiek. De pre-denaturatietijd werd uitgebreid tot 10 min om de bellen te verwijderen |
Als u meer informatie over de Universele samengestelde qPCR hoofdmengeling van TaqMan nodig hebt, te laten gelieve ons online het weten, dank u.
Contactpersoon: Ms Kris
Tel.: +8613049739311
